研究背景
酯作为一类重要的经济化学品，广泛应用于香料、调味剂、化妆品、肥皂、药物和除草剂等。以往的文献报导中，羧酸还原酶(CAR)是一种能将羧酸转化为醛的酶，而在水条件下的酶催化酯化反应并不常见。本文报道了一种以ATP、Mg2+和NADPH为共底物，CAR催化的新反应。 虽然现有的催化技术如Fischer酯化反应和Steglich酯化反应能够有效生成酯类化合物，但这些反应并不环保，因为它们需要使用有机溶剂、不可生物降解的催化剂和高温条件。于是作者将目标转向了更为环保的CAR催化反应。 图1. 酵母中从葡萄糖到香草醛的合成途径（a:3-脱氢莽草酸脱水酶; b: (Nocardia iowensis) NiCAR和O-甲基转移酶; c:糖基转移酶） CAR催化羧酸还原成醛（图1），其结构与NRPS相似。首先，ATP用于羧酸的酰基化，形成酰基-AMP中间体。通过硫代反应，酰基AMP中间体连接到CAR的磷酸丙氨酸(PCP)基团上后，将硫酯中间体转移到还原酶区，在那里NADPH被用于还原，从蛋白质中释放出醛产物（图2）。 图2. CAR催化机理 研究内容 作者的目标是探索CAR除了能催化羧酸还原和酰胺化外，是否还能催化水中的酯化反应，为将来在代谢工程细胞中的应用奠定基础。在上述工作的启发下，作者首先在甲醇中进行了以苯甲酸为底物的CAR反应。除了苯甲醛产物的形成外，还检测到了一种微量的副产物生成，经鉴定为苯甲酸甲酯。为了提高苯甲酸甲酯的产率，作者对反应条件进行了调整，以最大限度地提高CAR生产酯类的能力。通过改变缓冲体系的pH来检测pH对苯甲酸甲酯产率的影响。实验发现，在pH为10.0的100 mM Na2CO3缓冲体系中，苯甲酸甲酯的产率最高，为0.59%（表1）。 表1. pH对苯甲酸甲酯生成的影响 随后，根据CAR的催化机理——反应的第一步是形成酰基-AMP和酰基-PCP来激活羰基，从而更容易受到亲核进攻，作者推测大多数酯化反应还需要活化羧酸以促进亲核加成。于是作者将有助于激活羧酸的化合物添加到缓冲液中并监测了所有反应将肉桂酸转化为肉桂酸甲酯的情况（表2）。 表2. 利于激活羧酸的化合物对肉桂酸甲酯形成的影响 结果表明，在以上七种添加的化合物中，浓度为100 mM的咪唑是提高肉桂酸甲酯产量的最有效化合物（表2）。其作为独立缓冲液的最佳浓度为200 mM（图3）。 图3. 咪唑缓冲液浓度对肉桂酸甲酯产率的影响 其次，作者考察了温度及甲醇浓度对肉桂酸甲酯产量的影响。结果表明，CAR在温和的温度下工作效率最高，即25⁰C（图4）以及当甲醇浓度高于5.5%时，肉桂酸甲酯的产率下降，这可能是由于其对CAR的抑制作用（图5）。 图4. 温度对肉桂酸转化为肉桂酸甲酯的影响 图5. 甲醇浓度对肉桂酸酯化反应的影响 咪唑作为提高肉桂酸甲酯产量的最有效化合物，使得作者对其促进CAR催化酯化的机理进行了进一步研究。作者推测咪唑或与酰基-AMP中间体反应生成酰基咪唑，从而以某种方式加速酯化反应，或作为酯化反应的酸/碱催化剂（图6）。 图6. 1) 咪唑与酰基-AMP中间体反应生成酰基咪唑 2) 作为酯化反应的酸/碱催化剂 实验证明，在没有咪唑的情况下，CAR不能将肉桂咪唑和乙醇转化为酯，从而排除了酰基咪唑是CAR催化酯化反应的中间体的可能性。这些数据表明，咪唑很可能在酯化过程中作为一种普通的酸/碱催化剂来介导质子转移（图7）。 图7. Buffer A: 100 mM Na2CO3 pH 10.0; Buffer B: 200 mM Imidazole pH 10.0 为了阐明还原酶区和PCP基团在CAR催化酯化反应中的作用，作者比较了trCAR（去除还原酶区的CAR）和S685A apoCAR （不能连接PCP）突变体以及S685A trCAR（不能连接PCP且去除了还原酶区）突变体对酯化反应的影响。结果显示，所有酶的活性相似，表明还原酶区和PCP基团不参与酯化反应（图8)。 图8. 突变后的CAR对酯化反应的影响 为了探索CAR在水环境中与其他已知催化酯化反应的酶相比的底物宽泛性和对反应条件的偏好，作者探索了CAR与脂肪酶（Novozyme 435）和MsAcT在类似条件下的酯化反应（表3）。 结果表明，脂肪酶在水环境下（产物生成量为0-2%）不能催化有效的酯化反应，而CAR可以有效催化酯化反应（产物生成量为3.5-43%），其中包括抗炎剂（阿魏酸甲酯）、具有烟草花叶病毒抑制活性的酯（4-羟基苯乙酸甲酯）、含卤素的酯（2，4-二氯苯氧乙酸甲酯）以及FDA批准的防晒活性成分（肉桂酸）(表3)。而在MsAcT催化酯化反应中，这些较大体积酸的直接酯化反应明显受阻。结果表明，在水相条件下，CAR在直接酯化反应中明显优于脂肪酶和MsAcT，特别是在以大体积芳香酸为底物的直接酯化反应中，CAR的催化效果明显优于脂肪酶和MsAcT。（表3） 表3. CAR与脂肪酶和MsAcT 总结 综上所述，羧酸还原酶CAR能够在25⁰C温和的水溶液条件下将羧酸转化为酯，具有较宽的底物范围。CAR的这种新活性可用于全细胞生物催化剂或代谢工程应用来合成酯，因为它在pH为7.5时也能很好地发挥作用。然而，CAR的缺点是使用昂贵的ATP作为共基质，这在未来需要进一步的工艺优化。
