从贯叶连翘中分离得到两个新的多环多戊烯基间苯三酚(PPAPs)，即Hyperfols A(1)和B(2)，以及两个已知的生物合成相关前体化合物(3和4)。化合物1是罕见的具有5/5/9/5四环骨架的2，3-Seco-PPAP，化合物2具有30-norPPAP。通过光谱分析、计算机辅助结构解析软件和电子圆二色谱计算确定了它们的结构。此外，化合物1和4通过诱导细胞凋亡对人红白血病细胞具有显著的细胞毒作用。
//研究背景
多环多戊烯基间苯三酚(PPAPs)是一类结构有趣的代谢物，其特点是高氧酰基间苯三酚密集地被戊烯基或香叶基侧链取代。PPAP是由单环多戊烯基间苯三酚(MPAPs)生物合成而来，然后进一步环化形成不同类型的PPAP，如金刚烷、螺环、桥环和其他一些复杂的骨架。到目前为止，大约有700种天然的多酚结合蛋白是从藤黄属中分离出来的，它们表现出非常广泛的生物活性，包括细胞毒性、抗菌、抗氧化和抗抑郁活性。因此，PPAPs的研究正成为有机合成和药理学领域的研究热点。
正在进行的金丝桃属植物中结构独特的PPAP进行研究的，有两个新的PPAP，hyperfols A(1)和B(2)(图1)，从贯叶连翘地上部分分离得到两个已知生物合成相关的前体化合物：Hyhenrone A(3)和Hyperurone E(4)。化合物1具有不寻常的5/5/9/5稠合四环体系，具有稀有的九元氧环和两个γ-内酯环。化合物2是C30或非双环多戊烯基酰化间苯三酚(BPAP)类似物的第一个例子。在这里，描述了这些化合物的结构解释，看似合理的生物合成途径，以及细胞毒性评价。
图1.化合物1和2的结构
//结构解析
Hyperfols A(1)，根据13C NMR和高分辨质谱数据分析其分子式C35H50O6。1HNMR谱显示3个烯烃质子[δH4.82(1H，t，J=7.2 Hz)，4.96(1H，t，J=7.2 Hz)和5.2 0(1H，t，J=7.2 Hz)]和11个单线甲基。1的13C和极化转移(DEPT)无畸变增强NMR数据显示35个碳，包括3个戊烯基。此外，剩余的20个碳信号被归属于5个甲基、3个亚甲基、2个亚胺和10个季碳，其中观察到1个酮、2个酯羰基和4个双键。上述官能团占7个不饱和度，其余4个不饱和度暗示存在四环系统。
通过分析其2D NMR数据，进一步确定1的平面结构(图2A)。1H−1H COSY相关性显示存在四个结构片段a−d，如图2中粗键所示。通过异核多键相关谱(δC81.4)，从Me-35到C-1，C-8和C-29，从H-31到C-1和C-8，从Me-33和Me-34到C-31和C-32(C81.4)很容易地构建了一个带有异丙氧基的环(环A)。根据H-31与C-2(δC 173.8)和C-10(δC137.9)以及Me-12和Me-13与C-11和C-10的HMBc关联，异丁烯基和酯羰基(C-2)通过C-1连接到A环。片段a和b可以很容易地通过Me-35与C-7和C-8的关键HMBC关联起来。此外，通过H2-6和H2-19与C-4、C-5和C-9的HMBC关联，片段b和c、羰基(C-4)和酯羰基(C9)通过C-5相互连接。同样，通过H2-14与C-3和C-4的HMBC关联验证了d单元和C-4通过四元C-3的连接。因此，具有六个“松散末端”的结构可以如图2A所示。然而，由于与这些基团相关的季碳化合物的存在以及缺乏关键的HMBC相关性，这六个“松散末端”之间的联系极具挑战性。计算机辅助结构解释(CASE)是近几年发展起来的一项通过数据解释来组装复杂结构的技术。实验数据包括分子式和1的1D和2DNMR数据输入到ACD/结构解析器中，可以产生209个分子并进行筛选。通过软管(dA)和神经网络(dN)方法显示了最高的R2值和最低的标准差值(图3)，因此，确定了1的平面结构，如图3所示。
图2.化合物1关键的HMBC、1H−1H和ROESY相关
图3.采用Struc Eluc软件，预测神经网络方法进行线性回归图
ROESY光谱来确定化合物1的相对构型(图2B)，其中H-31/Me-35/H-24a和Me-12/Me-35/H-6β的相关性表明，这些基团位于分子的同一侧，并随机指定为β定向的。此外，H-19/H-6、α/H-7和H-14/H-20的ROESY相关性表明这些群体是以α为导向的。因此，1的相对结构被阐明，如图2所示。
根据其HR-ESI-MS数据确定hyperfols B(2)的分子式为C29H40O5。对其1D和2DNMR数据的分析表明，2与hyphenrone A(3)相似。不同之处在于2中存在α，β不饱和酮单元(δC201.6、139.1和150.6)，而不是3中存在的戊烯基。此外，在HMBC谱(图4)中，H-24到C-8，H-7和Me-29与C-8，C-1和C-2的相关关系进一步构成了2的平面结构。根据ROESY谱确定了它的相对构型，其中H-19b/H6α/H-7和H-14a/H-20的关联表明这些质子是α取向的，而H-6β/H-24a的相关性表明它们是β取向的(图4)。据我们所知，所有来自单环多戊烯基酰化间苯三酚(MPAP)前体的PPAP都显示在C-8上存在二甲基，2丢失30-甲基是一种新的PPAP。
图4.化合物2的关键HMBC、1H−1H COSY和ROESY的相关性.
用含时密度泛函理论(TDDFT)方法在B3LYP/6-311+g(d，p)或CAM-B3LYP/TZVP水平上计算了1和2的绝对构型。将理论计算数据与实验数据进行比较(图5)，可以将1和2的绝对构型分别指定为1R、3R、5R、7S、8R、31R和3S、5R、7S。
图5. 化合物1和2的实验和计算的ECD谱
假设的生物发生途径为1−4，如路径1所示。中间体(3)可由MPAP经烷基化、环化、氧化、还原-羟醛缩合等一系列反应得到，2进一步氧化得到4。重要的中间体I是通过拜尔−维利格氧化形成的。酯环被打开，双键被氧化得到关键中间体II。最后，以II为原料，通过醚化和酯化反应合成了一个特殊的5/5/9/5四环骨架(1)。相反，中间体III是通过MPAP在C-8的氧化而损失一个30-甲基得到的。
路径1.化合物1-4的生物合成途径
中间体IV由III经Aldol缩合而得，再经逆转Aldol反应和OH-8脱水得到化合物2。多环多戊烯基衍生物已被报道对白血病有抑制作用。因此，我们测定了所有分离株对白血病细胞系HEL和K562的细胞毒活性。化合物1和4对HEL细胞有明显的细胞毒作用，IC50值分别为5.01和7.38μM。此外，流式细胞仪检测结果表明，化合物1和4均能诱导HEL细胞凋亡，并呈剂量依赖关系(图6A，B)。但是，由于化合物1的量较少，所以使用了化合物4进行进一步的研究。观察化合物4对细胞凋亡标志蛋白caspase-3和PARP表达的影响。结果表明，4可促进caspase-3和PARP1的裂解水平表达(图6C)。总体而言，化合物1和4通过诱导细胞凋亡对HEL细胞具有细胞毒作用。
图6.
(A,B)化合物1和4诱导HEL细胞凋亡24小时
(C) Western blot显示，化合物4不同浓度处理HEL细胞24小时后，所示抗体表达活化的caspase-3和PARP。
综上所述，从贯叶连翘地上部分分离到两个前所未有的PPAP，分别为hyperfol A(1)和hyperfol B(2)。Hyperfols A(1)具有罕见的5/5/9/5四环系统的骨架和2有新颖的30-norPPAP。化合物1和2的新颖结构吸引了合成化学家的兴趣。此外，化合物1和4通过诱导细胞凋亡对HEL细胞具有明显的细胞毒作用。
//原文信息
本文于2020年8月21日在线发表于ACS旗下期刊Organic Letters上。第一作者为Hua-Yong Lou和Ya-Nan Li，通讯作者为Chun-Mao Yuan和Xiao-Jiang Hao。通讯单位为贵州医科大学药用植物功效与利用国家重点实验室。
原文地址：
https://dx.doi.org/10.1021/acs.orglett.0c02434
